{"id":13879,"date":"2018-07-04T15:16:58","date_gmt":"2018-07-04T13:16:58","guid":{"rendered":"http:\/\/www.bmscience.net\/blog\/?p=13879"},"modified":"2024-02-12T21:31:48","modified_gmt":"2024-02-12T20:31:48","slug":"determinazione-della-struttura-primaria-di-una-proteina-tramite-sequenziamento","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/bmscience.net\/blog\/determinazione-della-struttura-primaria-di-una-proteina-tramite-sequenziamento\/","title":{"rendered":"Determinazione della struttura primaria di una proteina tramite sequenziamento"},"content":{"rendered":"\n<p>Il metodo del sequenziamento di proteine fu messo a punto da parte dello scienziato F. Sanger.<br>La determinazione della sequenza primaria della catena polipeptidica attualmente viene fatta in maniera automatica in modo molto veloce da strumenti abbastanza complessi chiamati <strong>sequenziatori<\/strong> (automatici) che sono presenti disponibili in vari laboratori, mentre nel 1958, quando \u00e8 stato messo a punto questo metodo da Sanger, ci volevano parecchi anni per sequenziare una proteina.<\/p>\n\n\n<div id=\"bmscience1939488535\" style=\"float: right;\"><script async src=\"\/\/pagead2.googlesyndication.com\/pagead\/js\/adsbygoogle.js?client=ca-pub-3495866718878812\" crossorigin=\"anonymous\"><\/script><ins class=\"adsbygoogle\" style=\"display:block;\" data-ad-client=\"ca-pub-3495866718878812\" \ndata-ad-slot=\"3435444406\" \ndata-ad-format=\"auto\" data-full-width-responsive=\"true\"><\/ins>\n<script> \n(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({}); \n<\/script>\n<\/div>\n\n\n<p>\u00c8 possibile conoscere la composizione amminoacidica di una proteina, ossia il tipo e il numero di amminoacidi che costituiscono la proteina, andando a <strong>denaturare<\/strong> completamente la proteina. Le condizioni altamente denaturanti sono quelle che si ottengono in ambiente fortemente basico o fortemente acido facendo bollire la proteina in una soluzione 6 M di HCl, che \u00e8 una concentrazione altissima di acido, in questo modo i singoli legami peptidici che tengono insieme l\u2019amminoacido vengono rotti, queste sono condizioni estreme ed \u00e8 chiaro che la proteina non solo \u00e8 denaturata, ossia perde la sua conformazione, ma si ha l\u2019idrolisi di tutti i legami peptidici e la proteina viene rotta nelle sue parti costitutive. In questo modo otteniamo una miscela di amminoacidi che costituisce la nostra proteina di interesse e viene analizzata con una tecnica chiamata <strong>HPLC<\/strong> (<em>high performance liquid cromatografy<\/em>) oppure con una cromatografia a scambio ionico.<\/p>\n\n\n<div class=\"wp-block-image\">\n<figure class=\"alignleft is-resized\"><img decoding=\"async\" src=\"https:\/\/upload.wikimedia.org\/wikipedia\/commons\/thumb\/7\/7e\/Sanger_peptide_end-group_analysis.svg\/770px-Sanger_peptide_end-group_analysis.svg.png\" alt=\"\" style=\"width:327px;height:auto\"\/><figcaption class=\"wp-element-caption\">Fonte: <a href=\"https:\/\/upload.wikimedia.org\/wikipedia\/commons\/thumb\/7\/7e\/Sanger_peptide_end-group_analysis.svg\/770px-Sanger_peptide_end-group_analysis.svg.png\">Wikipedia<\/a><\/figcaption><\/figure>\n<\/div>\n\n\n<p>Queste sono delle tecniche cromatografiche che permettono di determinare la tipologia degli amminoacidi e quindi di risalire al numero ma soprattutto al tipo di amminoacidi che costituiscono la nostra proteina. Tuttavia in questo modo, avendo frammentato la proteina, non potremmo mai conoscere l\u2019ordine con cui sono legati e quindi ricostruire la nostra proteina.<\/p>\n\n\n\n<p>Un altro tipo di metodo permette di marcare l\u2019amminoacido N-terminale facendolo reagire con un marcativo che si chiama <strong>1 fluoro 2,4 dinitrobenzene<\/strong> (<strong>FDNB<\/strong>) anche noto come <strong>reattivo di Edman<\/strong>. Infatti il metodo di sequenziamento delle proteine che va sotto il nome di Sanger pu\u00f2 essere chiamato anche <strong>degradazione di Edman<\/strong>, scienziato che ha scoperto e messo in evidenza la capacit\u00e0 di far reagire FDNB con il gruppo amminico dell\u2019amminoacido N-terminale che \u00e8 l\u2019unico a presentare il gruppo amminico libero. Successivamente in ambiente acido (6 M HCl) si ha la rottura dei legami peptidici, compreso quello dell&#8217;amminoacido legato al FDNB permettendo di evidenziarlo.<\/p>\n\n\n<div class=\"wp-block-image wp-image-13880\">\n<figure class=\"alignright is-resized\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"888\" height=\"456\" src=\"http:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2018\/07\/feniltioidantoinaPTHCondizioniblandeacide-e1530708915177.jpg\" alt=\"\" class=\"wp-image-13880\" style=\"width:452px;height:auto\" srcset=\"https:\/\/bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2018\/07\/feniltioidantoinaPTHCondizioniblandeacide-e1530708915177.jpg 888w, https:\/\/bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2018\/07\/feniltioidantoinaPTHCondizioniblandeacide-e1530708915177-300x154.jpg 300w, https:\/\/bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2018\/07\/feniltioidantoinaPTHCondizioniblandeacide-e1530708915177-768x394.jpg 768w\" sizes=\"auto, (max-width: 888px) 100vw, 888px\" \/><figcaption class=\"wp-element-caption\">Fonte: <a href=\"https:\/\/www.google.com\/url?sa=i&amp;rct=j&amp;q=&amp;esrc=s&amp;source=images&amp;cd=&amp;cad=rja&amp;uact=8&amp;ved=2ahUKEwiwgunzvoXcAhWIWBQKHSnfAGwQjhx6BAgBEAM&amp;url=http%3A%2F%2Fslideplayer.it%2Fslide%2F10569624%2F&amp;psig=AOvVaw24PtRsRE3alziwXE2OZBd8&amp;ust=1530795184942197\">Slide Player<\/a><\/figcaption><\/figure>\n<\/div>\n\n\n<p>Il passo successivo \u00e8 stato quello di utilizzare il <strong>PTC<\/strong> (<strong>fenilisotiocianato<\/strong>), un altro reattivo che in ambiente basico crea un addotto legandosi con la catena polipeptidica. Poi si tratta il mix di reazione variando il pH da basico a acido si ottiene la rottura del legame peptidico con la formazione dell\u2019addotto pi\u00f9 stabile con il PTC formando il <strong>PTH<\/strong> (<strong>feniltioidantoina<\/strong>). Quindi a pH basico abbiamo il legame tra il gruppo amminico sul carbonio del PTC, si formano questi due metaboliti intermedi e cambiando il pH da basico a acido otteniamo la rottura dell\u2019amminoacido N-terminale con la formazione di PTH.<\/p>\n\n\n<div class=\"wp-block-image wp-image-13882\">\n<figure class=\"alignleft is-resized\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"464\" height=\"310\" src=\"http:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2018\/07\/acido-performico.jpg\" alt=\"\" class=\"wp-image-13882\" style=\"width:464px;height:auto\" srcset=\"https:\/\/bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2018\/07\/acido-performico.jpg 464w, https:\/\/bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2018\/07\/acido-performico-300x200.jpg 300w\" sizes=\"auto, (max-width: 464px) 100vw, 464px\" \/><figcaption class=\"wp-element-caption\">Fonte: <a href=\"https:\/\/amzn.to\/420RXHG\" target=\"_blank\" rel=\"noreferrer noopener\">I principi di biochimica di Lehninger.<\/a><\/figcaption><\/figure>\n<\/div>\n\n\n<p>A questo dobbiamo aggiungere delle operazioni che precedono il sequenziamento di una proteina, perch\u00e9 quando andiamo a sequenziare una proteina, dobbiamo tener conto anche della sua struttura terziaria e quaternaria se presente, quindi dobbiamo ottenere le singole catene polipeptidiche andando a sequenziare una per volta. Si procede allora con la rottura del ponte disolfuro in ambiente acido ad esempio con l\u2019<strong>acido performico<\/strong> oppure trattando la proteina con un agente molto basico che \u00e8 il <strong>DTT<\/strong> (<strong>ditiotreitolo<\/strong>) oppure il <strong>\u03b2-SH<\/strong> (<strong>\u03b2-mercaptoetanolo<\/strong>). Questi ultimi due sono caratterizzati dalla presenza di gruppi tiolici che sono in grado di ridurre il ponte disolfuro ossia riportarlo allo stato ridotto, di gruppi tiolici singoli.<br>Quando si utilizza l&#8217;acido performico, il ponte di solfuro viene rotto formando residui di acido cisteico che impediscono ai gruppi solforati di ricongiungersi a formare il ponte disofuro.<\/p>\n\n\n<div id=\"bmscience1737085159\" style=\"margin-top: 15px;margin-bottom: 15px;margin-left: auto;margin-right: auto;text-align: center;\"><a href=\"https:\/\/amzn.to\/4n3hOt1\" target=\"_blank\" aria-label=\"9b0b9447-4770-4713-8589-c51ab09f1323\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" src=\"https:\/\/bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/06\/9b0b9447-4770-4713-8589-c51ab09f1323-scaled.jpg\" alt=\"\"  srcset=\"https:\/\/bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/06\/9b0b9447-4770-4713-8589-c51ab09f1323-scaled.jpg 2560w, https:\/\/bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/06\/9b0b9447-4770-4713-8589-c51ab09f1323-300x65.jpg 300w, https:\/\/bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/06\/9b0b9447-4770-4713-8589-c51ab09f1323-1024x221.jpg 1024w, https:\/\/bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/06\/9b0b9447-4770-4713-8589-c51ab09f1323-768x166.jpg 768w, https:\/\/bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/06\/9b0b9447-4770-4713-8589-c51ab09f1323-1536x332.jpg 1536w, https:\/\/bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/06\/9b0b9447-4770-4713-8589-c51ab09f1323-2048x443.jpg 2048w\" sizes=\"auto, (max-width: 2560px) 100vw, 2560px\" width=\"2560\" height=\"553\"  style=\"display: inline-block;\" \/><\/a><\/div>\n\n<div class=\"wp-block-image\">\n<figure class=\"alignright size-full is-resized\"><a href=\"https:\/\/amzn.to\/3TUiOU0\" target=\"_blank\" rel=\"noreferrer noopener\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"500\" height=\"727\" src=\"https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2024\/01\/41z8x487zNL.jpg\" alt=\"\" class=\"wp-image-18262\" style=\"width:159px;height:auto\" srcset=\"https:\/\/bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2024\/01\/41z8x487zNL.jpg 500w, https:\/\/bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2024\/01\/41z8x487zNL-206x300.jpg 206w\" sizes=\"auto, (max-width: 500px) 100vw, 500px\" \/><\/a><figcaption class=\"wp-element-caption\"><strong><a href=\"https:\/\/amzn.to\/3TUiOU0\" target=\"_blank\" rel=\"noreferrer noopener\">Acquista ora<\/a><\/strong><\/figcaption><\/figure>\n<\/div>\n\n\n<p>La reazione con il PTC pu\u00f2 essere ripetuta fino a 60 volte e permette di determinare la sequenza primaria di frammenti di una proteina non molto lunghi fino a 40-60 residui amminoacidici, perch\u00e9 a un certo punto la reazione non pu\u00f2 andare avanti, si accumulano i vari metaboliti che vengono prodotti e la reazione viene stoppata. Questo vuol dire che dato che ci sono moltissime proteine che sono formate da pi\u00f9 di 60 frammenti allora la proteina prima di essere sottoposta a sequenziamento viene frammentata in vari segmenti di grandezza al di sotto di 40-60 monomeri e questo si pu\u00f2 fare con gli enzimi digestivi come la <strong>tripsina<\/strong> che rompe i legami peptidici in corrispondenza di arginina (R) e della lisina (K) e poi questi brevi segmenti vengono sottoposti a reazione con PTC, rilevamento del segnale del singolo amminoacido con le tecniche cromatografiche e cos\u00ec si ottiene la sequenza di questi frammenti. Ora il problema \u00e8 metterli in ordine.<br>Tramite trattamento con FDNB possiamo identificare in maniera univoca l\u2019amminoacido N-terminale. Per poter mettere in ordine i vari frammenti che noi abbiamo ottenuto con il taglio proteolitico della tripsina utilizziamo un altro agente di taglio, ossia facciamo la stessa operazione di taglio della stessa proteina, per\u00f2 con un altro agente che pu\u00f2 essere un altro enzima proteolitico. Il trucco \u00e8 quello di tagliare la stessa proteina in punti diversi e sequenziare questi frammenti ottenuti da questa seconda reazione in maniera tale che i frammenti che noi otteniamo con questo secondo reagente siano sovrapponibili rispetto agli altri, cio\u00e8 quando viene sequenziato troveremo dei tratti che sono in comune, un <strong>overlapping<\/strong> della sequenza e in questo modo in maniera univoca possiamo andare a metterli in ordine e ottenere la sequenza completa e precisa di questa proteina, dal N-terminale che noi abbiamo identificato con FDNB fino a C-terminale che sar\u00e0 l\u2019amminoacido finale della nostra sequenza polipeptidica.<\/p>\n\n\n\n<p>Le sostanze chimiche che possono essere utilizzate per il sequenziamento sono: la tripsina che taglia in corrispondenza di K (lisina) ed R (arginina), la proteasi sottomascellare, un enzima non umano, che rompe in corrispondenza di R, oppure la chimotripsina o la proteasi V8 dello stafilococco aureo o la proteasi N-aspartato, la pepsina, l\u2019endoproteinasi lisina C, oppure il bromuro di cianogeno che \u00e8 l\u2019unico che non \u00e8 un enzima, cio\u00e8 una proteina.<\/p>\n\n\n\n<blockquote class=\"wp-block-quote is-layout-flow wp-block-quote-is-layout-flow\">\n<p>Fonte: <a href=\"https:\/\/amzn.to\/420RXHG\" target=\"_blank\" rel=\"noreferrer noopener\">I principi di biochimica di Lehninger.<\/a><\/p>\n<\/blockquote>\n\n\n<div id=\"bmscience2758667905\" style=\"margin-top: 15px;margin-bottom: 15px;margin-left: auto;margin-right: auto;text-align: center;\"><a href=\"https:\/\/amzn.to\/4l5awDk\" target=\"_blank\" aria-label=\"ezgif-274b711575da66\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" src=\"https:\/\/bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/06\/ezgif-274b711575da66.gif\" alt=\"\"  width=\"800\" height=\"160\"  style=\"display: inline-block;\" \/><\/a><\/div>","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Il metodo del sequenziamento di proteine fu messo a punto da parte dello scienziato F. Sanger.La determinazione della sequenza primaria della catena polipeptidica attualmente viene fatta in maniera automatica in modo molto veloce da strumenti abbastanza complessi chiamati sequenziatori (automatici) che sono presenti disponibili in vari laboratori, mentre nel 1958, quando \u00e8 stato messo a&hellip;<\/p>\n<p class=\"more\"><a class=\"more-link\" href=\"https:\/\/bmscience.net\/blog\/determinazione-della-struttura-primaria-di-una-proteina-tramite-sequenziamento\/\">Continue reading <span class=\"screen-reader-text\">Determinazione della struttura primaria di una proteina tramite 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