{"id":13888,"date":"2018-07-04T15:44:24","date_gmt":"2018-07-04T13:44:24","guid":{"rendered":"http:\/\/www.bmscience.net\/blog\/?p=13888"},"modified":"2024-02-12T21:29:00","modified_gmt":"2024-02-12T20:29:00","slug":"cromatografia-a-scambio-ionico-per-esclusione-molecolare-e-per-affinita","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/bmscience.net\/blog\/cromatografia-a-scambio-ionico-per-esclusione-molecolare-e-per-affinita\/","title":{"rendered":"Cromatografia a scambio ionico, per esclusione molecolare e per affinit\u00e0"},"content":{"rendered":"
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Fonte: Rete-dida.it<\/a><\/figcaption><\/figure>\n<\/div>\n\n\n

La cromatografia<\/strong>, \u00e8 una tecnica di tipo separativo che si basa sull\u2019utilizzazione di colonne e si sfrutta come principio di separazione la forza di gravit\u00e0, che richiede un certo tempo abbastanza lungo. Per aumentare la velocit\u00e0 di discesa del campione la colonna pu\u00f2 essere collegata ad una pompa peristaltica che applica una certa pressione e quindi aumenta di una certa velocit\u00e0 il deflusso dell’analita.
Ogni sistema cromatografico \u00e8 costituito da una fase stazionaria (fase fissa) e una fase mobile (eluente). La fase stazionaria<\/strong> \u00e8 il materiale con cui \u00e8 riempita la nostra colonna e, a seconda del tipo di cromatografia, presenta diverse tipologie che stabiliscono il principio che viene utilizzato per separare quella determinata proteina dalle altre. Ci sono diversi tipi di cromatografia e un diverso grado di risoluzione per le diverse tecniche cromatografiche. La fase mobile<\/strong> \u00e8 la soluzione in cui si trova disciolto il nostro analita che dobbiamo determinare.
Il principio di separazione delle proteine pu\u00f2 essere la massa oppure la carica elettrica, dipende dal tipo di materiale con cui \u00e8 costituita la fase stazionaria.<\/p><\/p>\n\n\n

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<\/span>Cromatografia a scambio ionico<\/span><\/h3>\n\n\n
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Fonte: Slide Player<\/a><\/figcaption><\/figure>\n<\/div>\n\n\n

Un esempio classico di cromatografia utilizzata in molti laboratori \u00e8 la cromatografia a scambio ionico<\/strong> in cui la fase stazionaria \u00e8 costituita da una resina che pu\u00f2 essere policationica o polianionica, formata da delle biglie con cariche negative oppure positive a seconda di quello che vogliamo andare a separare. Se per esempio noi vogliamo separare una proteina basica dalle altre (basica vuol dire che a pH fisiologico presenta una o pi\u00f9 cariche nette di tipo positivo) prepareremo la nostra provetta con uno scambiatore anionico con delle cariche negative in maniera tale che la nostra proteina carica positivamente si lega mentre tutte le altre fuoriescono, ossia faremo una sorta di filtrazione, quindi le proteine che sono acide, cariche negativamente, si respingono con le biglie di resina e fuoriescono, mentre invece la nostra proteina basica rimarr\u00e0 legata. Per poter recuperare la nostra proteina, cambiamo le condizioni di pH, di forza ionica all\u2019interno della resina e otteniamo in un secondo passaggio la nostra proteina purificata. Questo \u00e8 il principio generale su cui si basa la cromatografia a scambio ionico (che pu\u00f2 essere cationico<\/strong> oppure anionico<\/strong>).<\/p><\/p>\n\n\n

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<\/span>Cromatografia per esclusione molecolare (filtrazione su gel)<\/span><\/h3>\n\n\n
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Fonte: Slide Player<\/a><\/figcaption><\/figure>\n<\/div>\n\n\n

Un altro tipo di cromatografia molto utilizzata \u00e8 la cromatografia per esclusione molecolare<\/strong>, anche chiamata cromatografia per filtrazione su gel<\/strong>. Ci\u00f2 che sta nella colonna \u00e8 formato da una resina costituita da biglie, che non si vedono a occhio nudo, che costituiscono la fase stazionaria. Esse sono forate e permettono il passaggio di molecole. Sono disponibili commercialmente delle resine con determinati cut-off. Pi\u00f9 grande \u00e8 la proteina, prima esce, perch\u00e9 le molecole pi\u00f9 piccole del cut-off sono quelle che avranno un percorso arzigogolato all\u2019interno delle singole palline che entrano e poi escono, mentre tutto ci\u00f2 che \u00e8 al di sopra del valore di cut-off, non pu\u00f2 andare all\u2019interno di questi fori e quindi fuoriesce prima. Questa \u00e8 generalmente l\u2019applicazione che viene utilizzata. Ovviamente il sistema cromatografico \u00e8 collegato a un sistema collettore che servir\u00e0 per raccogliere l’analita da separare.<\/p><\/p>\n\n\n

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<\/span>Cromatografia per affinit\u00e0<\/span><\/h3>\n\n\n
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Fonte: Slide Player<\/a><\/figcaption><\/figure>\n<\/div>\n\n\n

Un terzo tipo di cromatografia \u00e8 quella per affinit\u00e0<\/strong>. Questo tipo di cromatografia offre un grado di risoluzione maggiore perch\u00e9 utilizza un legame specifico del ligando, della proteina, con un antigene specifico legato sulla resina. Viene utilizzato un particolare epitopo della nostra proteina, cio\u00e8 una particolare regione della proteina. Viene costruito un ligando e montato sulla resina in maniera tale che sia altamente specifico per la proteina di interesse, quindi viene applicato il nostro campione su un sistema cromatografico che contiene un certo numero di proteine, per\u00f2 il ligando che \u00e8 presente nella resina \u00e8 specifico soltanto per la nostra proteina, quindi solo la nostra proteina si andr\u00e0 a legare con questo ligando che si trova nella resina e poi alla fine per poter recuperare la nostra proteina di interesse possiamo aggiungere una soluzione molto concentrata di una specie chimica che compete con lo stesso ligando, per\u00f2 in maniera pi\u00f9 specifica tanto che spiazza la proteina e si va a legare al ligando, in modo tale da recuperare la proteina, oppure possiamo variare notevolmente la concentrazione ionica, aumentare notevolmente la forza ionica determinando una rottura del legame tra la resina della nostra proteina in maniera tale da poterla recuperare.<\/p><\/p>\n\n\n\n

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Fonte: I principi di biochimica di Lehninger.<\/a><\/p>\n<\/blockquote>\n\n\n

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