{"id":13907,"date":"2018-07-05T09:32:24","date_gmt":"2018-07-05T07:32:24","guid":{"rendered":"http:\/\/www.bmscience.net\/blog\/?p=13907"},"modified":"2024-02-12T20:01:38","modified_gmt":"2024-02-12T19:01:38","slug":"tecniche-per-lanalisi-delle-proteine-western-blotting","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/bmscience.net\/blog\/tecniche-per-lanalisi-delle-proteine-western-blotting\/","title":{"rendered":"Tecniche per l’analisi delle proteine: Western Blotting"},"content":{"rendered":"
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In inglese blot<\/em>, o blotting<\/em>, significa trasferimento<\/strong>. Il western blotting consiste nel trasferimento di proteine da un supporto ad un altro, in genere dal gel a un altro supporto come la membrana di nitrocellulosa,<\/strong> oppure un polimero fatto di PVDF (PoliViniliDenFluoruro)<\/strong>, un polimero sintetico su cui si possono legare le proteine.
Il termine “western” ha un\u2019origine curiosa perch\u00e9 alcuni scienziati avevano scoperto la possibilit\u00e0 di trasferimento di queste macromolecole da un supporto ad un altro a partire dagli acidi nucleici mettendo in pratica il cosiddetto “Southern blotting<\/strong>“. Proprio uno scienziato che si chiamava Southern aveva dato il proprio cognome alla tecnica. Il southern blotting \u00e8 lo stesso tipo di tecnica del western blotting con la sola differenza che ad essere trasferite non sono le proteine ma il DNA. Per analogia \u00e8 stato applicato questo tipo di tecnica di trasferimento anche all\u2019RNA e in questo caso \u00e8 stato chiamato northern blotting<\/strong>. Quando \u00e8 stato utilizzato per le proteine gli \u00e8 stato dato il nome di western blotting.
Questo tipo di tecnica presuppone l\u2019avvenuta migrazione su gel delle proteine quindi \u00e8 una tecnica analitica che presuppone una corsa elettroforetica<\/a>. Quindi al termine della corsa elettroforetica del nostro campione iniziale, le proteine separate sul gel, possono essere ulteriormente identificate con questa tecnica.<\/p>\n\n\n

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Dopo la corsa elettroforetica il primo passaggio del western blotting \u00e8 il trasferimento delle proteine dal gel a un supporto solido che \u00e8 la membrana polimerica.<\/p>\n\n\n\n

Il secondo passaggio \u00e8 l\u2019allestimento del sandwich<\/strong> come illustrato in figura. Il trasferimento delle proteine dal gel alla membrana avviene tramite applicazione di un campo elettrico perch\u00e9 le proteine intrappolate nel gel mantengono la loro carica e quindi, in opportune condizioni, viene sottoposto ad un campo elettrico che permette la migrazione verso il polo positivo. \u00c8 una normale prosecuzione della tecnica del SDS-PAGE<\/strong> dove le proteine sono tutte cariche negativamente e quindi la migrazione si ha sempre verso il polo positivo.
Per poter traferire queste proteine si allestisce il sandwich formato da vari strati di carta assorbente perch\u00e9 ci deve essere un po\u2019 di isolamento tra il campo elettrico e l\u2019accoppiamento gel-membrana. Durante le operazioni di trasferimento bisogna stare attenti a capire il verso giusto. Per poter ottenere il trasferimento delle proteine che sono cariche negativamente verso il polo positivo dobbiamo montare tutto l\u2019apparato sul polo negativo quindi dobbiamo avere il gel, poi la membrana che va verso il polo positivo e alla fine abbiamo il coperchio del nostro strumento che \u00e8 il trasferitore<\/strong> che corrisponde al polo positivo. Bisogna seguire quest\u2019ordine perch\u00e9 se si monta al contrario, cio\u00e8 se si mette prima la membrana e poi il gel, poich\u00e9 il trasferimento si ha sempre verso il polo positivo le proteine invece di andare verso la membrana verranno trasferite sullo strato di carta con cui ricopriamo il gel.
Ci sono altri modelli di trasferitore delle proteine dove si monta tutto al contrario quindi si comincia con il polo positivo, poi si mette la membrana e sulla membrana si mette il gel. Importante \u00e8 conoscere il verso: se c\u2019\u00e8 prima il polo positivo si mette prima la membrana nel caso contrario in cui c\u2019\u00e8 prima il polo negativo si mette prima il gel.
Accorgimenti tecnici a cui bisogna prestare attenzione sono la formazione delle<\/strong> bolle<\/strong>. Quando si crea il sandwich per ottimizzare il trasferimento delle proteine dal gel alla membrana non ci deve essere nessuna bolla d\u2019aria perch\u00e9 in caso contrario, le proteine corrispondenti alla bolla d’aria non verrebbero e quando alla fine dell\u2019esperimento si va a colorare la membrana ci si trova una bolla bianca dove non si sono trasferite le proteine. Difatti, un\u2019operazione che si fa quando si allestisce il sandwich, \u00e8 di passare una specie di rullo sul sandwich dove c\u2019\u00e8 la membrana pi\u00f9 gel in maniera tale da far uscire tutta l\u2019aria.<\/p>\n\n\n

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Fonte: Wikipedia<\/a><\/figcaption><\/figure>\n<\/div>\n\n\n

Il passaggio successivo \u00e8 il trasferimento<\/strong> delle proteine sulla membrana. La direzione di trasferimento va dal catodo all’anodo. Si collega il generatore di corrente elettrica e otteniamo la nostra membrana. Alla fine dell\u2019operazione di trasferimento si ottiene la membrana, su cui abbiamo trasferito le nostre proteine, che generalmente \u00e8 bianca. L\u2019operazione di trasferimento \u00e8 necessaria perch\u00e9 successivamente bisogna identificare la nostra proteina di interesse attraverso la reazione con un anticorpo specifico per quella proteina: questa \u00e8 la finalit\u00e0 dell\u2019esperimento di western blotting. La reazione tra un anticorpo specifico di una proteina e quella proteina avviene molto meglio quando la proteina non si trova sul gel perch\u00e9 \u00e8 molto pi\u00f9 difficile che una proteina che si trova all\u2019interno delle maglie della poliacrilammide reagisca con un anticorpo specifico. Pu\u00f2 avvenire ma con una sensibilit\u00e0 molto minore.<\/p>\n\n\n

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Il trasferitore di ultima generazione si chiama trans-blot turbo transfer system<\/strong>. Nella storia delle tecniche biochimiche si sono succeduti vari tipi di strumenti che vengono utilizzati per il trasferimento. In particolare ce ne sono tre che si chiamano rispettivamente sistema di trasferimento ad immersione, sistema semi-drive e sistema trans-blot turbo. Turbo sta ad indicare la velocit\u00e0 di trasferimento.
Fino a pochi anni fa una delle tappe limitanti in un esperimento di western blotting era il tempo richiesto per il trasferimento perch\u00e9 richiedeva almeno 3 giorni. Invece con la messa a punto di questo strumento il trasferimento da over-night \u00e8 stato ridotto a 15 minuti ed \u00e8 per questo motivo che si chiama turbo<\/strong>. Il principio \u00e8 sempre lo stesso: c\u2019\u00e8 un campo elettrico che viene applicato, soltanto che \u00e8 stato ottimizzato al tal punto da richiedere un tempo brevissimo. Cos\u00ec le proteine che si trovano sulla membrana possono essere visualizzate.
Quando trasferiamo le nostre proteine sulla membrana, la membrana che inizialmente era bianca continua ad essere bianca perch\u00e9 le proteine per poterle visualizzare hanno bisogno di un metodo di colorazione. Ci\u00f2 che noi vediamo sulla membrana sono soltanto le proteine del marker che erano gi\u00e0 precolorate e che continuano ad essere colorate sulla membrana. Per essere sicuri che abbiamo trasferito le proteine \u00e8 possibile colorarle con un colorante rosso chiamato rosso blusseau<\/strong>.<\/p>\n\n\n

Caricamento….<\/p><\/div><\/div>\n\n

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La terza fase \u00e8 l\u2019incubazione della membrana con l\u2019anticorpo primario<\/strong> che si lega alla nostra proteina di interesse. Bisogna quindi scegliere un anticorpo che sia diretto contro la proteina di interesse. Molto spesso questi anticorpi che vengono messi in commercio sono aspecifici, cio\u00e8 non si vanno solo a legare all\u2019epitoco della proteina di nostro interesse, ma vanno anche a legarsi con altre proteine ottenendo come risultato finale delle bande aspecifiche. Per mettere in evidenza questo legame tra anticorpo e proteina l\u2019anticorpo primario, che \u00e8 quello diretto contro la nostra proteina, viene a sua volta fatto reagire con un anticorpo secondario.<\/p>\n\n\n

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Quindi dopo l\u2019incubazione con l\u2019anticorpo primario, si fanno degli opportuni lavaggi e, nella vaschetta che contiene la membrana, viene aggiunto un anticorpo secondario<\/strong> che \u00e8 specifico per il suo anticorpo primario. Quando si aggiunge l\u2019anticorpo secondario bisogna tener conto della specie animale in cui \u00e8 stato prodotto l\u2019anticorpo primario. L\u2019esposizione di un determinato organismo come ad esempio l\u2019uomo a un determinato antigene innesca la risposta immunitaria con la produzione di anticorpi e lo stesso principio vale anche per la produzione di anticorpi che si utilizzano in laboratorio.
L\u2019anticorpo secondario ha la capacit\u00e0 di essere rilevato in chemi-luminescenza,<\/strong> ci\u00f2 significa che \u00e8 coniugato con un enzima che permette lo sviluppo di luce che non \u00e8 luce visibile ma luce rilevabile con uno strumento chemi-luminescente. Gli anticorpi secondari pi\u00f9 utilizzati in laboratorio sono quelli che sono coniugati, per questo tipo di tecnica, con un enzima che \u00e8 l\u2019HRP<\/strong>, horseradish peroxidase che catalizza la reazione del H2<\/sub>O2<\/sub> per formare H2<\/sub>O e O2<\/sub>. In presenza di un substrato che \u00e8 luminolo<\/strong>, il luminolo pi\u00f9 H2<\/sub>O2<\/sub> d\u00e0 una reazione che \u00e8 di tipo chemi-luminescente, cio\u00e8 la luce viene rilevata dallo strumento e questo poi si traduce nella visualizzazione della banda proteica. I substrati dell\u2019enzima quindi sono H2<\/sub>O2<\/sub> e luminolo. In presenza della perossidasi il luminolo diventa attivato perch\u00e9 l\u2019H2<\/sub>O2<\/sub> viene scissa in H2<\/sub>O e O2<\/sub> e questo diviene il segnale di chemi-luminescenza. Questa reazione di sviluppo di chemi-luminescenza non dura perennemente nel tempo ma decade, quindi la velocit\u00e0 di acquisizione dell\u2019immagine deve essere abbastanza elevata e bisogna procedere velocemente.<\/p>\n\n\n

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Il risultato che noi abbiamo \u00e8 un risultato tipo quello riportato in figura. La parte grigia (in realt\u00e0 \u00e8 bianca) \u00e8 la membrana su cui abbiamo trasferito tutte le nostre proteine. Noi volevamo andare ad analizzare solo una proteina che si chiama beta-actina quindi abbiamo fatto l\u2019incubazione con l\u2019anticorpo primario anti-beta-actina, l\u2019incubazione con l\u2019anticorpo secondario e in cui \u00e8 stato prodotto l\u2019anti-beta-actina e il segnale chemi-luminescente che si ottiene sono le bande nere che corrispondono alla proteina nelle varie lane<\/em>. Le lane<\/em> sono distinte tra di loro perch\u00e9 HeLa, 293T, U2OS\u2026 sono tutti nomi di linee cellulari che si utilizzano comunemente in laboratorio. Per esempio HeLa sono le prime cellule messe in Henrietta Lacks che era quella donna da cui hanno prelevato le cellule della cervice uterina.<\/p>\n\n\n\n

L\u2019utilit\u00e0 del western blotting \u00e8 che l\u2019intensit\u00e0 delle bande si pu\u00f2 tradurre in un numero con l\u2019analisi densitometrica. Dall\u2019intensit\u00e0 delle bande possiamo ottenere una variazione dell\u2019espressione della proteina X in base a trattamenti che noi abbiamo fatto o in base all\u2019influenza di segnali intracellulari o extracellulari.<\/p>\n\n\n\n

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Fonte: I principi di biochimica di Lehninger.<\/a><\/p>\n<\/blockquote>\n\n\n

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