{"id":13914,"date":"2018-07-05T10:22:51","date_gmt":"2018-07-05T08:22:51","guid":{"rendered":"http:\/\/www.bmscience.net\/blog\/?p=13914"},"modified":"2025-06-13T08:17:56","modified_gmt":"2025-06-13T06:17:56","slug":"lisoelettrofocalizzazione-lelettroforesi-bidimensionale-e-la-blue-native-page","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/bmscience.net\/blog\/lisoelettrofocalizzazione-lelettroforesi-bidimensionale-e-la-blue-native-page\/","title":{"rendered":"L’isoelettrofocalizzazione, l’elettroforesi bidimensionale e la blue native PAGE"},"content":{"rendered":"\n

L’isoelettrofocalizzazione o isoelettrofocusing (IEF<\/strong>) \u00e8 una tecnica che permette una separazione delle molecole proteiche o di peptidi, che sono pi\u00f9 piccoli delle proteine, in base al punto isoelettrico<\/strong>. La separazione delle varie molecole proteiche, caratterizzate ognuna del proprio punto isoelettrico, dipende essenzialmente dalla composizione amminoacidica che ci permette di distinguere le proteine acide, basiche e p anche neutre che comunque presentano un valore isoelettrico compreso tra 6 e 7.5\/8.<\/p>\n\n\n

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Caricamento…<\/p><\/div><\/div><\/div>\n\n\n

Per ottenere la separazione bisogna caricare il campione su uno STRIP<\/strong>, una colonnina oppure una striscia di gel di poliacrilammide, che  \u00e8 stata premiscelata con una soluzione di anfoliti, sostanze ognuna caratterizzata da una stessa carica che si dispongono lungo la strip di gel a formare un gradiente di pH, Queste strip commercialmente sono presente in vari tipi: intervallo di pH basico, intervallo di pH acido, a  seconda della proteina che dobbiamo andare a separare. Quindi si applica con la pipetta il campione e si sottopone lo strip di gel alla migrazione applicando un campo elettrico (in quanto si tratta sempre di una tecnica elettroforetica che utilizza la migrazione di una particella carica sottoposta ad un campo elettrico).<\/p>\n\n\n\n

La differenza, rispetto alle altre tecniche, soprattutto la SDS-PAGE<\/strong><\/a>, \u00e8 che con essa otteniamo la separazione delle molecole proteiche, dato che sono tutte cariche negativamente, in base al peso molecolare, alla massa molecolare della macromolecola. In questo caso, invece, con la miscela di proteine che abbiamo depositato sull\u2019inizio della strip, in uno dei due punti, le particelle migreranno fino a quando non giungeranno in quella regione del gel il cui pH corrisponde al punto isoelettrico della proteina. Quindi possiamo vedere una separazione di bande di questo tipo. Questo si ottiene after staining, cio\u00e8 dopo la colorazione, in quanto noi non riusciamo a seguire la corsa.<\/p>\n\n\n

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Elettroforesi bidimensionale<\/h2>\n\n\n
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Un campione di proteine pu\u00f2 essere stratificato su un\u2019estremit\u00e0 di una striscia di gel, dove \u00e8 presente un gradiente stabile di pH. In alternativa, lo stesso campione di proteine, sospeso in una soluzione di anfoliti, pu\u00f2 essere, invece, utilizzato per reidratare una striscia di gel disidratata. Viene applicato il campo elettrico, dopo la colorazione le proteine risultano distribuite lungo il gradiente di pH secondo il loro valore di punto isoelettrico. Questa separazione in isoelettrofocalizzazione, pu\u00f2 essere seguita da una seconda tappa elettroforetica che costituisce l\u2019esempio di elettroforesi bidimensionale<\/strong>.
Dopo opportuni passaggi di solubilizzazione delle proteine che si trovano all\u2019interno della matrice porosa di poliacrilammide, questa striscia di gel montata sul secondo gel viene sottoposta ad un campo elettrico e questo serve per ottenere la separazione delle proteine che si trovano in ogni banda proteica ottenuta con la prima separazione. Tutto questo presuppone che ogni banda proteica che abbiano ottenuto con la prima separazione, \u00e8 costituita da un certo numero di subunit\u00e0. Con la seconda dimensione, otteniamo la separazione delle varie subunit\u00e0 e l\u2019identificazione di tutte o quasi tutte le proteine che si trovano in ogni banda e che vengono quindi visualizzate poi nel gel di seconda dimensione, sempre dopo colorazione, come degli spot (ossia dei puntini, come infatti si pu\u00f2 notare in questa parte a destra, ogni spot corrisponde ad una proteina).<\/p>\n\n\n

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Paragonando il risultato della bidimensionale ottenuto dall\u2019immagine di sinistra rispetto a quella di destra, ad occhio il ricercatore pu\u00f2 notare che c\u2019\u00e8 la scomparsa di uno degli spot nel gel di destra; questo pu\u00f2 corrispondere ad una regolazione di una proteina in uno stato patologico o in seguito ad un trattamento con un farmaco, dipende da quello che si sta studiando. Serve quindi come applicazione di uno screening iniziale per poter identificare la proteina coinvolta in quel determinato pathway o in una determinata via metabolica.<\/p>\n\n\n\n

Per poter poi identificare la proteina specifica bisogna analizzare in dettaglio, come per esempio si pu\u00f2 fare con la spettrometria di massa, che permette l\u2019identificazione in base alla massa di una proteina e quindi di essere sicuri di quale proteina sia coinvolta nello studio che stiamo facendo. Spot che si trovano pi\u00f9 in basso sono quelle che hanno un peso molecolare pi\u00f9 basso a differenza di quelle che si trovano pi\u00f9 in alto (stesso principio di separazione di altre tecniche).<\/p>\n\n\n

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Blue native PAGE<\/h3>\n\n\n
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Un tipo molto particolare di elettroforesi bidimensionale \u00e8 rappresentato dalla blue native PAGE <\/strong>(dove PAGE significa elettroforesi su gel poliacrilammide), ed \u00e8 un tipo di tecnica elettroforetica che viene molto utilizzata dai mitocondriologi.
\u00c8 sempre una tecnica elettroforetica bidimensionale, quindi c\u2019\u00e8 una prima dimensione che permette la separazione, nel caso dei mitocondri, dei complessi respiratori, e poi nella seconda dimensione ogni complesso viene suddiviso nelle varie subunit\u00e0 proteiche. Si chiama \u201cblue<\/strong>\u201d perch\u00e9 la sostanza fondamentale che viene utilizzata \u00e8 il \u201cblue comassie\u201d (comassie blue G250) che colora di blu tutti campioni, anche i buffer di corsa che vengono utilizzati. Si chiama, invece, \u201cnative<\/strong>\u201d perch\u00e9 \u00e8 un\u2019elettroforesi di tipo nativo, in quanto i complessi della catena respiratoria che vengono separati con questa tecnica devono necessariamente mantenere la propria conformazione nativa, infatti al termine della separazione dei vari complessi, si pu\u00f2 anche effettuare un saggio di funzionalit\u00e0. Per esempio, al complesso primo, che \u00e8 il primo nel gel perch\u00e9 \u00e8 il pi\u00f9 pesante, se si aggiunge, in opportune condizioni sperimentali, il NADH che \u00e8 il trasportatore di elettroni e protoni nel complesso primo, si osserva l\u2019ossidazione del NADH a NAD+<\/sup>, a testimoniare la funzionalit\u00e0 dell\u2019enzima, e cos\u00ec dicasi per gli altri complessi.<\/p>\n\n\n\n

La conformazione nativa si pu\u00f2 preservare trattando le nostre cellule, che derivano da una coltura cellulare o da un omogenato di tessuto,  con degli agenti solubilizzanti che riescano a solubilizzare le membrane (per\u00f2 non troppo perch\u00e9 se fossero degli agenti troppo aggressivi porterebbero anche alla dissociazione dei complessi come quelli della catena respiratoria formati da un insieme di subunit\u00e0). Quindi, per fare questo, utilizziamo dei detergenti blandi, che sciolgono le membrane, per\u00f2 preservano la struttura nativa, come la digitonina<\/strong> (un detergente blando che funziona formando dei pori sulle membrane biologiche, e pu\u00f2 essere pi\u00f9 o meno blando a seconda della concentrazione che noi utilizziamo). La digitonina svolge anche il ruolo di purificazione dei mitoplasti (un derivato dei mitocondri, un mitocondrio privato della membrana esterna costituito dalla membrana interna con i complessi della catena respiratoria che rimangono in conformazione nativa ancora sulla membrana).<\/p>\n\n\n

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La funzione delle altre sostanze come il comassie blu G250 e l\u2019acido aminocaproico, \u00e8 quella di conferire una leggera carica negativa ai complessi. L\u2019acido aminocaproico <\/strong>\u00e8 una sostanza acida che viene utilizzata sia nella fase di solubilizzazione che nella costituzione del gel. Anche il gel che viene utilizzato per mettere in pratica questo tipo di tecnica, \u00e8 sempre un gel di poliacrilammide, per\u00f2 \u00e8 un gel nativo. E’ assolutamente bandito l\u2019SDS (sodio dodecil solfato) perch\u00e9 \u00e8 l\u2019agente denaturante pi\u00f9 forte. Se i mitocondri vengono a contatto con l\u2019SDS si denatura tutto e non riusciamo a venire a contatto con la conformazione nativa.<\/p>\n\n\n\n

Questo tipo di elettroforesi viene utilizzata per i mitocondri ma anche per altri organuli cellulari, come i cloroplasti oppure complessi multienzimatici, come quelli della catena respiratoria. La distribuzione dei complessi \u00e8 in base al peso molecolare. Il complesso I \u00e8 quello che ha un peso molecolare maggiore, con 45 o pi\u00f9 subunit\u00e0, e poi a scalare complesso quinto, terzo, quarto e secondo.
Se vogliamo dissociare i vari complessi della catena nelle subunit\u00e0 mettiamo un medium di solubilizzazione<\/strong> che contiene agenti denaturanti tipo il \u03b2-SH, il \u03b2-mecarptoetanolo e si ottiene alla fine, dopo che il gel viene colorato, un pattern elettroforetico, in cui ogni singola banda corrisponde ad ogni singola subunit\u00e0 dei complessi. Non vengono visualizzate tutte e 45 le subunit\u00e0 del complesso primo, ma soltanto quelle che si trovano in questo intervallo di peso molecolare.<\/p>\n\n\n

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Acquista ora<\/a><\/strong><\/figcaption><\/figure>\n<\/div>\n\n\n

Un avanzamento nella letteratura scientifica ha dimostrato che i complessi della catena respiratoria sono organizzati in maniera associata, si trovano associati tra di loro in maniera tale che il passaggio degli elettroni da un complesso all\u2019altro attraverso i trasportatori ausiliari, che sono il coenzima Q, o il citocromo C che collega il III col IV, sia ottimizzato per evitare perdite di energia, una situazione che comporterebbe l\u2019aumento di produzione dei radicali liberi. Nonostante sia molto difficile preservare la conformazione di questi super complessi<\/strong>, \u00e8 stato evidenziato che molte patologie umane sono collegate alla diminuzione dei super complessi. Tanto maggiore \u00e8 la presenza dei super complessi, tanto pi\u00f9 efficiente \u00e8 la produzione energetica della cellula e ci sono alcune patologie in cui si assiste ad una progressiva degenerazione della cellula e quindi dell\u2019organismo, in funzione della degenerazione mitocondriale misurata come diminuzione della costituzione dei super complessi. Essendo pi\u00f9 attivi i super complessi, rispetto ai complessi separati, in una patologia mitocondriale diminuiscono e aumenta lo stato patologico.<\/p>\n\n\n\n

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Fonte: I principi di biochimica di Lehninger.<\/a><\/p>\n<\/blockquote>\n\n\n

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