Per preparare uno striscio di sangue si effettuano 6 fasi: Prelievo, esecuzione dello striscio, fissaggio, colorazione, controllo, montaggio coprioggetti. Dopo aver eseguito queste fasi si può passare all’osservazione.
PRELIEVO:
Prima di preparare uno striscio di sangue bisogna prelevare il campione, quindi bisogna lavarsi bene un dito. Utilizzando un ago sterilizzato, si punge il polpastrello. Se si ha difficoltà nel fare questa operazione, potete aspettare il momento in cui accidentalmente vi fate una ferita. Nel frattempo, tenete sempre pronti e al riparo dalla polvere i materiali necessari, in particolare, i vetrini portaoggetti lavati.
ESECUZIONE DELLO STRISCIO:
Si deposita una piccola goccia di sangue verso una delle estremità del vetrino come si vede nell’immagine, in base a come meglio vi trovate. Adesso si avvicina un secondo vetrino alla goccia, con angolazione di 30-40 gradi finché essa aderirà e per capillarità si disporrà per tutta la lunghezza del secondo vetrino, quindi si muove il vetrino verso sinistra (o destra in base a quale estremità avete inserito la goccia) con un movimento costante e rapido in modo da realizzare lo striscio.
E’ importante evitare quantità eccessive di sangue, altrimenti i globuli rossi si sovrappongono ai leucociti nascondendoli e rendendo difficile l’osservazione al microscopio.
Una goccia di sangue può essere utilizzata per numerosi strisci, infatti, per realizzare uno striscio è sufficiente lasciare sul vetrino una piccola macchia di sangue di circa 3 mm di diametro. Inoltre è consigliato fare più strisci perché non sempre essi riescono bene, con tanti tentativi è più facile averne uno riuscito in modo soddisfacente.
Per evitare la formazione di coaguli, ogni striscio deve essere effettuato con sangue fresco e subito dopo averlo depositato. Per questo è bene farsi aiutare da un’altra persona. In modo che mentre una deposita il sangue, l’altra effettua gli strisci. Osservate al microscopio gli strisci per verificare che alcuni siano riusciti correttamente, altrimenti fatene degli altri. Gli eritrociti non devono né essere sovrapposti né troppo scarsi da risultare isolati e troppo distanti fra loro.
FISSAGGIO:
Se applicate il colorante sullo striscio senza averlo prima fissato, le cellule scoppieranno a causa del cosiddetto shock ipotonico. Questo avviene perché la concentrazione di sali all’interno delle cellule è molto più alta di quella del liquido colorante che è diluito in acqua distillata. Nel tentativo di eguagliare la concentrazione salina interna ai valori di quella esterna, le cellule si gonfiano per osmosi. Per raggiungere la stessa concentrazione salina del liquido esterno, le cellule dovrebbero gonfiarsi molto di più di quanto la loro membrana consente, infatti esplodono. Il contenuto delle cellule finisce all’esterno, e il preparato diventa inutilizzabile. Per evitare questo, prima della colorazione si deve effettuare un fissaggio dello striscio. Questa operazione ostacola il rigonfiamento delle cellule, che quindi rimangono integre quando vengono colorate.
Un semplice ed efficace fissaggio consiste nell’immergere lo striscio in un recipiente contenente alcool etilico o metilico al 95 % per 3-5 minuti. Per disporre alcool sul vetrino, potete anche utilizzare un contagocce o una spruzzetta.
Se si osserva lo striscio così com’è dopo il fissaggio, non vedrete quasi nulla perchè le cellule sono molto trasparenti. Le emazie sono leggermente visibili, ma i leucociti sono molto pallidi, quasi invisibili e non è possibile distinguere nulla al loro interno.
COLORAZIONE:
Per poter osservare e riconoscere i vari tipi di leucocita, è necessario colorarli. A tale scopo, normalmente si utilizza il liquido di “Giemsa” . Si tratta di una miscela di coloranti, a base di blu di metilene ed eosina. Si trova in commercio a poco prezzo nelle confezioni da 100 cc. Si tratta di una soluzione concentrata che deve normalmente essere diluita nel rapporto 1/10, cioè una parte di Giemsa in nove di acqua distillata, oppure di soluzione tampone (pH = 6,8-7,2). Si può acquistare il liquido Giemsa presso un magazzino di prodotti per laboratori chimici.
Per la colorazione, si prende un vetrino con lo striscio fissato ed asciutto. Si fa cadere sul vetrino tante gocce di colorante finché sarà coperto completamente. Si mantiene il colorante per circa 16′ cambiandolo circa quattro volte. Sciacquate il vetrino in acqua distillata alla temperatura ambiente. Sgocciolate e lasciate asciugare, eventualmente assorbendo l’eccesso di acqua senza toccare le cellule.
CONTROLLO:
Verificate con il microscopio che la colorazione sia riuscita bene. Se è necessario, applicate ancora il colorante per alcuni minuti. Se pensate di utilizzare il balsamo del Canada, dovete realizzare una colorazione più intensa.
MONTAGGIO DEL VETRINO COPRIOGGETTI:
A questo punto, il vostro striscio è pronto per l’osservazione, ma se volete conservarlo a lungo, dovete trasformarlo in un preparato permanente. A tale scopo, dopo aver lasciato asciugare il vetrino, fate cadere sullo striscio una goccia di balsamo del Canada o di un analogo liquido di montaggio, quindi montate il coprioggetti. Se il balsamo dovesse essere un po’ troppo viscoso, potete riscaldare leggermente (non oltre 40 °C) il vetrino per favorire lo scorrimento del balsamo tra i vetrini.
OSSERVAZIONE:
Un ingrandimento di 200 volte è sufficiente per osservare e identificare i differenti tipi di cellula. Tuttavia, un ingrandimento superiore vi permette di osservare meglio le cellule nei loro dettagli. Potete osservare subito lo striscio usando sia obiettivi a secco che ad immersione. In questo ultimo caso, se avete montato un coprioggetti, dovete aspettare almeno un giorno perché il balsamo si sia un po’ asciugato, altrimenti quando muoverete il vetrino l’olio farà spostare il coprioggetti.