La colorazione è l’ultima fase della preparazione di un campione istologico. Il campione che ha subito fissazione, disidratazione, diafanizzazione, inclusione ed è stato sezionato, va poi colorato.
La colorazione è un processo fondamentale perché permette di osservare fisicamente un campione e distinguere le sue componenti in base al diverso tipo di colorante utilizzato.
Quando si parla di colorazione bisogna fare una distinzione in quelle che sono le tecniche di colorazione e i coloranti.
In campo istologico ci sono tre importanti tecniche di colorazione: colorazione istologica, istochimica e immunoistochimica.
- La colorazione istologica permette di mettere in evidenza le caratteristiche morfologiche dei tessuti, permette quindi di studiare la struttura di un tessuto. Questa tecnica di colorazione utilizza tre tipi di coloranti: bicromici, tricromici e elettivi.
- La colorazione istochimica mette in evidenza le caratteristiche chimiche di un tessuto e si ottiene andando a sviluppare una vera e propria reazione chimica, il cui precipitato viene visto al microscopio.
- La colorazione immunoistochimica è una colorazione più specifica che mette in evidenza gli specifici antigeni presenti nelle cellule e nei tessuti.
COLORAZIONI ISTOLOGICHE:
Una colorazione istologica fondamentale è l’Azan-Mallory basata essenzialmente su tre colori:
- l’Azocarminio che permette di colorare delle strutture acide come il nucleo o in minor misure il citoplasma;
- il Blu di Anilina che è un colorante acido che permette di colorare delle strutture come fibre di collagene e muco;
- l’Orange G ha stessa funzione del blu di anilina.
Tuttavia l’Azan-Mallory è formata essenzialmente da due parti: l’Azocarminio e la miscela policroma di Mallory (formata da blu di anilina, orange G e acido ossalico).
La colorazione probabilmente più impiegata in istologia è l’Ematossilina-Eosina, una colorazione bicromica che sfrutta le proprietà acide e basiche delle cellule. E’ formata da due coloranti:
- l’ematossilina che conferisce una colorazione blu-violacea ed è un colorante basico, acidofico che si lega alle strutture acide della cellula come il nucleo formato da DNA, o il citoplasma delle cellule più attive che contengono molti ribosomi, formati da RNA;
- l’eosina che conferisce una colorazione rossa-rosa-arancio e colora le strutture più basiche.
Quindi, in generale, il nucleo viene colorato di blu-violaceo ed il citoplasma di un colore rosa-arancio.
La colorazione di Gomori è una colorazione istologica elettiva che colora solo un determinato elemento, in questo caso si utilizza per colorare le fibre reticolari. Il colorante utilizzato è a base di argento che ha una particolare affinità per le fibre reticolari. Ne deriva un tessuto in cui le fibre sono colorate di nero intenso su uno sfondo grigio-giallo.
Le colorazioni Sudan III e Sudan Black vengono utilizzate per evidenziare le cellule adipose e soprattutto le goccioline lipidiche in esse contenute. Il Sudan III viene utilizzato per colorarle in giallo, mentre il Sudan Black per colorarli di nero.
Queste colorazioni vengono applicate ai campioni che sono stati sezionati con il criomicrotomo, perché la fissazione viene fatta fisicamente e quindi congelando il campione e non fissandolo chimicamente che potrebbe eliminare i lipidi.
La colorazione di Nissl è una colorazione elettiva che viene utilizzata per colorare specificatamente la zona tigroide di Nissl. Il colorante utilizzato è il blu di Toluidina e viene utilizzato di solito su sezioni di paraffina che hanno 10 µm di spessore. La colorazione tipica del blu di Toluidina è una colorazione sul blu-azzurro.
La colorazione di Golgi-Cajal è una colorazione istologica che è specifica per il sistema nervoso centrale. Si prendono delle piccole sezioni fresche del sistema nervoso centrale, le si immergono per 1-6 giorni a 25 °C in una soluzione osmio-bicromica e successivamente in una soluzione di nitrato d’argento concentrato a 1% per 3 giorni. Una volta avvenuta la colorazione, si includono i pezzi in paraffina e si tagliano delle sezioni molto spesse di almeno 40-50 µm per avere una visione abbastanza completa di tutti gli elementi. E’ una colorazione abbastanza difficile da praticare che presenta ancora delle problematiche irrisolte. Di solito si ottiene un buon risultato quando si hanno le cellule nervose che spiccano di un colore nero intenso su uno sfondo color tabacco.
Un’altra colorazione istologica è il May-Grunwald-Giemsa, una colorazione specifica per il sangue in cui si striscia il sangue su un vetrino portaoggetti che poi viene fissato per 30 minuti all’aria, in seguito viene colorato prima con la miscela May-Grunwald e poi viene lavato con il Giemsa. Il May-Grunwald è formato da Blu di Metilene ed Eosina. Il primo è un colorante basico, il secondo, come già detto in precedenza, è un colorante acido. Il Giemsa è fatto da Eosina, Blu di Metilene, Azzurro A e B e Violetto di Metilene.
Il risultato che si ottiene è che i globuli rossi risultano colorati di un rosa-arancio e i nuclei dei globuli bianchi in blu-violaceo.
COLORAZIONI ISTOCHIMICHE:
La reazione PAS serve per mettere in evidenza le mucine neutre presenti negli epiteli secernenti e ghiandole endocrine, ma anche nel sistema nervoso. Per la reazione si utilizza innanzitutto un ossidante, l’acido periodico che attacca in maniera specifica il gruppo funzionale amminico primario delle mucine oppure il gruppo H. In seguito all’attacco viene liberato il gruppo aldeico che viene messo in evidenza dal colorante, il reattivo di Shiff. Questo colorante colora le mucine con il gruppo aldeico mostrato di un colore rosso porpora. Di solito questa reazione si esegue in associazione all’Alcian blu.
Mentre la reazione PAS colora le mucine neutre, l’Alcian blu colora le mucine acide e i glicosamminoglicani. Entrambi devono avere i gruppi carbossilici COOH. Questa reazione di solito si esegue insieme alla reazione PAS in modo da avere un quadro completo delle mucine che sono presenti nel preparato, sia le mucine acide che quelle neutre.
Un esempio di reazione combinata PAS-Alcian blu si utilizza per colorare alcune parti dello stomaco come l’antro.
COLORAZIONI IMMUNOISTOCHIMICHE:
La colorazione immunoistochimica sfrutta il legame antigene anticorpo. Gli anticorpi utilizzati per questa colorazione vengono trattati con l’aggiunta di un cromogeno che in seguito alla reazione anticorpo-antigene, viene eccitato da un laser che marcherà il cromogeno il quale renderà evidente la reazione avvenuta. In questo modo è possibile osservare le cellule in cui è avvenuta questa reazione.