Le seguenti procedure sono tutte le tecniche che vengono applicate in un campione per l’analisi microscopica dopo che esso è stato prelevato. Le fasi principali sono la fissazione, la disidratazione, la chiarificazione, l’inclusione, il sezionamento, la colorazione e il montaggio. Queste fasi sono necessarie prima di un’osservazione microscopica.
- FISSAZIONE:
La fissazione è la tappa basilare di procedura dopo aver prelevato un campione; essa consente di immobilizzare e conservare tutte le componenti chimiche e fisiche del campione da osservare. La fissazione può essere effettuata tramite metodo fisico o tramite metodo chimico.- Il metodo fisico viene effettuato per l’esame estemporaneo e consiste nel congelamento del campione che viene inserito in azoto liquido con una temperatura di -170 °C. I campioni istologici che possono essere processati tramite questo metodo vengono sezionati per mezzo di un criomicrotomo che consente di sezionare a temperature basse.
- Il metodo chimico si avvale dell’utilizzo di fissativi chimici che bloccano i processi generativi della cellula e vengono scelti in base al risultato che si vuole ottenere. Per esempio possono essere utilizzati l’alcol etilico quando si vogliono perdere i lipidi o le aleidi (come la formaldeide o formalina) quando si vogliono conservare i lipidi.
- DISIDRATAZIONE:
La disidratazione, come anche la diafanizzazione, viene effettuata solo per i campioni fissati chimicamente. Essa consiste nell’allontanamento dell’acqua tramite l’immersione del campione in alcool etilico a diverse concentrazioni: partendo da 50%, 70%, 90%, 95% e infine 100%. La presenza di acqua nel campione lo rende molle e quindi difficile da sezionare, per questo viene eliminata. - DIAFANIZZAZIONE:
La diafanizzazione o chiarificazione è la fase successiva alla disidratazione che consente al campione di diventare trasparente per poter essere attraversato dalla luce del microscopio. Per questa fase si utilizza come reattivo lo xilolo che è un composto organico che oltre a chiarificare il campione, solubilizza i lipidi e scioglie l’etanolo. - INCLUSIONE:
L’inclusione consente al campione di avere una consistenza tale da poter essere tagliato. La sostanza da aggiungere deve essere liquida alle alte e solida alle basse temperature. Le sostanze che vengono utilizzate sono la paraffina fusa (fonde a 60 °C) e la resina epossidica. Dall’immersione del campione si ottiene quindi un blocco compatto che verrà poi sezionato. La paraffina viene usata per la microscopia ottica perché non c’è bisogno di una consistenza particolarmente dura; la resina epossidica si utilizza per la microscopia elettronica, in cui si utilizzano sezioni più sottili. 
SEZIONAMENTO:
Il sezionamento consiste nel taglio del campione istologico in diverse sezioni che devono avere lo stesso spessore. Queste sezioni devono avere lo spessore di 3-10 µm, uno spessore tale che permette alla luce di passare la sezione e poter essere osservata al microscopio.
La sezione viene effettuata con il microtomo in un meccanismo automatico che consente di scegliere il migliore taglio.- ALLESTIMENTO DEL VETRINO:
Dopo aver sezionato il campione, le sezioni vengono poggiate su un vetrino portaoggetti su cui è stata inserita una sostanza adesiva e si lascia asciugare. Il vetrino viene poi nuovamente immerso nello xilolo per eliminare la paraffina. - REIDRATAZIONE:
La fase successiva è la reidratazione che si ottiene immergendo il vetrino in soluzioni con delle concentrazioni via via decrescenti di alcool etilico: 100%, 95%, 90%, 70%. Il campione viene reidratato per consentire il legame con i coloranti, infatti i coloranti utilizzati sono idrofili. - COLORAZIONE:
La fase di colorazione permette di evidenziare o meglio marcare una componente cellulare in modo da poter facilitare l’osservazione al microscopio. La colorazione può essere di tre tipi: istologica, istochimica e immunochimica. Per un approfondimento sulla colorazione clicca qui. - MONTAGGIO:
Al termine della colorazione si effettua il montaggio che consente di conservare a lungo il preparato per eventuali future osservazioni. Per fare ciò si pone sul reperto il vetrino coprioggetti fissandolo con il balsamo del canada che è una resina adesiva. Poi si fa asciugare il vetrino in stufa a 40 °C.