Relazione sulla prova di estrazione del DNA

ESERCITAZIONE: Estrazione del DNA

OBIETTIVO: Estrazione del DNA dalla banana

RELAZIONE:

CENNI TEORICI:

Il DNA è la molecola che ha il compito di conservare e duplicare l’informazione biologica. Il DNA è una molecola filamentosa composta da unità che si ripetono, i nucleotidi, le cui basi, adenina, citosina, guanina e timina, formano il contenuto informativo genetico, il quale è tradotto con il codice genetico negli amminoacidi corrispondenti. La sequenza amminoacidica prodotta, detta polipeptide, forma le proteine.

Negli organismi eucarioti, il DNA è contenuto nel nucleo delle cellule. Salvo alcune eccezioni come le cellule del sangue dei mammiferi che sono prive di nucleo, tutte le cellule di un organismo vivente possiedono una copia di DNA. Partendo da questo presupposto, è possibile estrarre e rendere visibile il DNA dal nucleo della cellula tramite un procedimento abbastanza semplice.

PROCEDIMENTO:

1. Si predispongono tutti gli strumenti e i materiali utili per la prova sul banco di lavoro;
2. Si taglia a fette la banana e delicatamente la si pesta nel mortaio finché non si ottiene una poltiglia, in modo da separare il più possibile le cellule tra di loro e rompere le pareti cellulari fatte di cellulosa e pectina;
3. Si trasferisce la poltiglia di banana nel becker grande (da 400 mL);
4. Con una spatola di acciaio si prelevano 3 grammi di NaCl in polvere, servendosi di una bilancia tecnica, e li si inseriscono nel becker contenente il nostro materiale biologico (l’NaCl servirà per facilitare l’eliminazione delle proteine presenti nel citosol. Il procedimento si chiama tecnicamente salting-out e sfrutta l’aumento della forza ionica del mezzo. Inoltre, i cationi Na⁺ serviranno a neutralizzare le cariche negative portate dei gruppi fosfato del DNA, in modo da farlo staccare dalle molecole d’acqua e poi così farlo precipitare nell’etanolo);
5. Con una pipetta graduata o con un cilindro graduato si prelevano 10 mL di detersivo per piatti delicatamente. Durante il prelievo attraverso il cilindro graduato o con la pipetta, bisogna fare attenzione all’errore di parallasse: l’occhio deve essere alla stessa altezza in cui è il liquido e la vetreria deve essere perpendicolare al piano d’appoggio. Inoltre la concavità del liquido deve essere tangente alla linea di taratura;
6. Si versano i 10 mL di detersivo nel becker in modo molto delicato per evitare la formazione di bollicine e schiuma. Viene inserito il detersivo per piatti perché è uno sgrassante e quindi è in grado di rompere la membrana esterna delle cellule e la membrana nucleare formata da un doppio strato fosfolipidico e quindi liberare il DNA;
7. Con una bacchetta di vetro si omogeneizza la poltiglia in modo da favorire lo scioglimento del grasso delle membrane cellulari evitando sempre di formare la schiuma;
8. Si prelevano, aiutandosi con il cilindro graduato, 90 mL di H₂O distillata e li si versano nel becker facendoli scorrere lentamente lungo le pareti;
9. Si piega la carta da filtro in due metà e la si fa aderire all’imbuto bagnandola leggermente con l’acqua distillata;
10. Si versa la soluzione nella beuta da 250 mL filtrando il tutto tramite l’imbuto preparato precedentemente. Questa operazione va fatta posizionando la bacchetta di vetro sul becco del becker in modo da rallentare il flusso. Il materiale viene filtrato in modo da separare l’acido nucleico, ormai liberato grazie all’effetto sgrassante del detersivo, dai residui cellulari.
11. Si prelevano 5 mL di filtrato (ricco di DNA) tramite la pipetta graduata e li si inseriscono in un provettone. Il prelievo può essere facilitato inclinando la beuta.
12. Si inseriscono nel provettone 3 mL di succo di ananas, prelevati con un cilindro graduato, e si miscela lentamente (2 volte) sigillando il provettone con della carta parafilm. Questa operazione oltre a rendere l’ambiente acido, fa si che grazie alla bromelina, presente nel succo d’ananas, elimini gli istoni della cromatina rendendo quindi il DNA più puro;
13. Infine, sotto cappa, si prelevano 6 ml di alcol etilico con il cilindro graduato e si versano lentamente lungo le pareti del provettone. L’aggiunta di alcol consente la separazione del DNA dal resto della soluzione. Nell’alcol il DNA diventa visibile perché non è solubile e quindi precipita formando dei filamenti come quelli visibili nell’immagine accanto. (Per questa operazione è preferibile utilizzare dell’alcol etilico freddissimo per facilitare la precipitazione)

CONCLUSIONI:

La prova è andata a buon fine e grazie ai vari procedimenti è stato possibile separare e rendere visibile il DNA della banana come previsto. I filamenti bianchi che si ottengono alla fine sono DNA mescolato a RNA; infatti, se non si usa l’enzima RNAasi, è impossibile separare i due acidi nucleici.

Per comprendere meglio i passaggi da eseguire per svolgere la prova puoi osservare questo video.